Genetyka

Badania w zakresie genetyki norki europejskiej są bardzo ograniczone i wymagają pilnego uzupełnienia, zwłaszcza w kontekście postępującego w dużym tempie wymierania gatunku i zanikania jego licznych populacji, m.in. we Francji, Białorusi i Rosji. Tracone bezpowrotnie zasoby genetyczne w dużej części nie zostaną nigdy poznane i opisane, co stanowi niepowetowaną stratę z punktu widzenia poznawczego, ale również praktycznego – skąpe dane na temat wewnątrzpopulacyjnego i międzypopulacyjnego zróżnicowania genetycznego znacznie upośledzają skuteczność realizowanych działań restytucyjnych względem norki europejskiej, zwłaszcza w kontekście hodowli odtworzeniowej i zachowawczej, jak również reintrodukcji gatunku.

Pionierskie badania genetyczne nad norką europejską dotyczyły cytogenetyki gatunku i realizowane były w byłym ZSSR. Do dziś badania Volobuev’a i Ternovsky’ego, Volobuev’a i in., Graphodatsky’ego i in. oraz Graphodatsky’ego i Radjabli stanowią podstawowe źródło informacji na temat kariotypu M. lutreola. 

Diploidalna liczba chromosomów norki europejskiej wynosi 38, co stanowi liczbę typową dla wielu gatunków rodziny łasicowatych – u ponad 60% gatunków tej grupy 2n = 38. U przedstawicieli rodzaju Mustela diploidalna liczba chromosomów wynosi od 38 do 44. Co istotne, dla norki (wizona) amerykańskiej 2n = 30, co dodatkowo, na gruncie cytogenetycznym, dowodzi stosunkowo niskiego stopnia jej ewolucyjnego pokrewieństwa z norką europejską. Jednocześnie warto zauważyć, że identyczna diploidalna liczba chromosomów charakteryzuje blisko spokrewnione filogenetycznie z norką europejską gatunki – łasicę syberyjską, łasicę japońską, tchórza stepowego oraz tchórza czarnołapego, podczas gdy dla tchórza zwyczajnego 2n = 40.

Na garnitur chromosomowy M. lutreola składa się pięć par chromosomów metacentrycznych, dwie pary chromosomów subtelocentrycznych, pięć par chromosomów submetacentrycznych oraz siedem par chromosomów telocentrycznych (Ryc. 6). Chromosom X jest submetacentryczny, natomiast chromosom Y – metacentryczny. Podobnie jak u pozostałych przedstawicieli rodziny łasicowatych, chromosom Y jest najmniejszym chromosomem. Podstawowa liczba ramion autosomów (FNa) wynosi 58, co wskazuje na znaczne podobieństwo morfologii chromosomów pomiędzy norką europejską a łasicą syberyjską (oba gatunki mają taką samą diploidalną liczbę chromosomów i jednakową liczbę FNa). Wzorzec kariotypu norki europejskiej nie został jeszcze ustalony.

   Charakterystykę prążków G i C chromosomów norki europejskiej podają, odpowiednio, Graphodatsky i in. oraz Graphodatsky i in.. Opisany został również wzór prążków AgNOR (organizatory jąderka), uzyskane metodą srebrzenia przewężeń wtórnych chromosomów. Szczegółowe porównanie wzoru prążków G chromosomów norki europejskiej oraz norki (wizona) amerykańskiej, łasicy pospolitej Mustela nivalis, łasicy górskiej Mustela altaica, kuny japońskiej Martes melampus, borsuka europejskiego Meles meles i zorilli paskowanej Ictonyx striatus przedstawił Graphodatsky i in.. Zarówno pod względem wzoru prążków G, jak i liczby oraz morfologii chromosomów, norka europejska wykazuje duże podobieństwo do łasicy syberyjskiej. 

Genom norki europejskiej nie został zsekwencjonowany, a w bazie GenBank zdeponowano 158 sekwencji nukleotydowych (DNA i RNA) dla tego gatunku. Liczba ta obejmuje 61 fragmentów sekwencji genomu mitochondrialnego, w tym 30 reprezentujących haplotypy genu cytb (26 dla fragmentów o długości od 337 do 504 pz i cztery dla kompletnej sekwencji genu, o długości 1 140 pz) oraz 23 haplotypy dla regionu kontrolnego (długości od 357 do 990 pz). Dla porównania, liczba rekordów sekwencji nukleotydowych M. putorius i M. putorius furo, zdeponowanych w bazie GenBank wynosi 357 607, zaś N. vison – 19 550. 

Ze względu na wysokie podobieństwo cytogenetyczne i dowiedzione bliskie relacje filogenetyczne, wielkość genomu jądrowego norki europejskiej należy szacować, w oparciu o zsekwencjonowany genom fretki domowej (MusPutFur1.0, kod akcesyjny GenBank: NC_020638.1), na ok. 2 411 mln pz (Mb), zawartość par GC na ok 42%, a liczbę genów na ok. 27,3 tys..

Najlepiej poznanymi markerami genetycznymi u norki europejskiej są jądrowe sekwencje mikrosatelitarne (syn. krótkie powtórzenia tandemowe, ang. Short Tandem Repeats, STR; proste sekwencje powtarzalne, ang. – Simple Sequence Repeats, SSR), będące kilkunukleotydowymi, wielokrotnie powtarzającymi się tandemowo motywami sekwencyjnymi DNA. Znajdują one zastosowanie w badaniach filogenetycznych, analizie międzypopulacyjnego zróżnicowania genetycznego i wewnętrznej struktury genetycznej, detekcji zdarzeń ewolucyjnych w filogenezie norki europejskiej, rekonstrukcji filogeograficznych, a potencjalnie również identyfikacji hybryd międzygatunkowych M. lutreola × M. putorius. 

Lushnikova i in. prowadzili również różnicujące badania hybrydyzacyjne w oparciu o klonowane fragmenty genomu, uzyskane przy zastosowaniu restryktazy BamHI, dla norki europejskiej, tchórza europejskiego, łasicy syberyjskiej, gronostaja europejskiego, perewiaski marmurkowej Vormela peregusna oraz norki (wizona) amerykańskiej. Wynikiem tych badań było określenie gatunkowo specyficznych elektroforetycznych wzorców restrykcyjnych dla wskazanych gatunków. Wykonana w oparciu o nie analiza filogenetyczna wskazała istnienie największego podobieństwa pomiędzy M. lutreola, M. putorius oraz M. sibirica (wspólny węzeł), podczas gdy N. vison stanowiła takson najodleglejszy filogenetycznie względem norki europejskiej.

Nazwy markerów mikrosatelitarnych norki europejskiej składają się z unikalnego numery poprzedzonego skrótem Mlut. Cabria i in. zidentyfikowali osiem unikalnych loci mikrosatelitarnych M. lutreola: Mlut04 (kod akcesyjny GenBank: EF093582, motyw repetytywny (GT)16, pięć zidentyfikowanych alleli), Mlut08 (kod akcesyjny GenBank: EF093583, motyw repetytywny (GT)12, cztery zidentyfikowane allele), Mlut15 (kod akcesyjny GenBank: EF093585, motyw repetytywny (GT)14, pięć zidentyfikowanych alleli), Mlut20 (kod akcesyjny GenBank: EF093587, (GT)18, osiem zidentyfikowanych alleli), Mlut25 (kod akcesyjny GenBank: EF093588, motyw repetytywny (GT)15, sześć zidentyfikowanych alleli), Mlut27 (kod akcesyjny GenBank: EF093589, motyw repetytywny (GT)8NN(GT)14, dwa zidentyfikowane allele), Mlut32 (kod akcesyjny GenBank: EF093590, motyw repetytywny (GT)59, osiem zidentyfikowanych alleli), Mlut35 (kod akcesyjny GenBank: EF093591, motyw repetytywny (GT)15NNNN(GT)4NN(GT)7, cztery zidentyfikowane allele).

Z powodzeniem amplifikowano markery mikrosatelitarne norki europejskiej u innych gatunków rodziny łasicowatych, m.in. Mustela eversmannii, Mustela furo, Mustela sibirica, Mustela nivalis, Neovison vison, Martes martes i Martes foina (Cabria i in. 2007). Dowodzi to możliwości zastosowania markerów STR M. lutreola w badaniach nad genomami innych przedstawicieli rodziny Mustelidae. Z kolei ), Peltier i Lodé, Michaux i in., Lodé i in. oraz Cabria i in. pozytywnie ocenili możliwość wykorzystania sekwencji starterowych opracowanych do amplifikacji sekwencji mikrosatelitarnych w genomie norki (wizona) amerykańskiej (Mvi02, Mvi20, Mvi22, Mvi72, Mvi75, Mvi389, Mvi1843, Mvi054, Mvi111), tchórza zwyczajnego (PutFK1) oraz gronostaja europejskiego (Mer09, Mer22, Mer41) do badań w zakresie genetyki populacyjnej, filogenezy i filogeografii norki europejskiej.

Oprócz polimorfizmu neutralnych markerów genetycznych, analizowano u norki europejskiej również zróżnicowanie allozymów oraz genu drb z rodziny genów głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy II. Spośród przeanalizowanych przez Lodé i in. 36 loci allozymowych u norki europejskiej tylko dla czterech ustalono po dwie formy alleliczne (gen dla karboksylesterazy/EC 3.1.1.1 – est-2, gen dla NADP-zależnej cytosolowej dehydrogenazy jabłczanowej/EC 1.1.1.40 – me-1, gen dla dehydrogenazy jabłczanowej MDH/EC 1.1.1.37 – mdh-1 oraz gen dla białka niespecyficznego). Wszystkie pozostałe loci miały u norki europejskiej charakter monomorficzny, podczas gdy dla analizowanych równolegle próbek pochodzących od tchórza zwyczajnego, charakter polimorficzny miało dziewięć loci. Dla genu drb Becker i in. opisali dziewięć form allelicznych. Nishita i in. prowadzili analizy filogenetyczne w oparciu o sekwencję eksonu drugiego genu drb, wykazując ewolucyjne pokrewieństwo tej sekwencji u M. sibirica, M. itatsi oraz M. lutreola oraz jej międzygatunkowy polimorfizm, będący pośrednim dowodem działania doboru stabilizującego.

 Kompletny genom mitochondrialny norki europejskiej zsekwencjonowany został de novo w roku 2017 – długość uzyskanej sekwencji nukleotydowej wynosi 16 523 pz. Porównanie rozpoznanej sekwencji mitogenomu M. lutreola ze zdeponowanymi w GenBank’u kompletnymi sekwencjami genomów mitochondrialnych 24 gatunków rodziny łasicowate, wykonane w programie BLAST, wykazało podobieństwo na poziomie 86-99% (Tab. 2). Wykreślone w oparciu o rozpoznaną sekwencję mtDNA drzewo filogenetyczne wykazało wysokie pokrewieństwo norki europejskiej z tchórzem zwyczajnym i fretką domową oraz jej wyraźne zagnieżdżenie w kladzie grupującym również M. eversmanni, M. nigripes, M. sibirica oraz M. itatsi. Przy porównaniu sekwencji genomu mitochondrialnego norki europejskiej i tchórza zwyczajnego (kod akcesyjny GenBank: KT693383.1) wykazało niezgodność na poziomie 158 różnic jednonukleotydowych.

    Warto w tym miejscu tylko dodać, że opracowane zostały testy genetyczne różnicowej identyfikacji norki europejskiej. Metoda opracowana przez López-Giráldez i in. opiera się na amplifikacji gatunkowo specyficznej, jądrowej sekwencji mikrosatelitarnej Mel08, zgodnie z procedurą opisaną przez Domingo-Roura. Już na etapie oceny długości produktów amplifikacji odróżnić można M. lutreola i M. putorius (produkt długości 221 pz dla obu gatunków) od N. vison (amplikon o długości 436 pz), natomiast zastosowanie trawienia enzymem restrykcyjnym AciI pozwala na odróżnienie norki europejskiej od tchórza zwyczajnego. Wielką zaletą metody jest jej prostota i niski koszt wykonania, zaś jej wartość aplikacyjną podkreśla możliwość identyfikacji gatunków często współwystępujących i należących do tej samej gildii ekologicznej w Europie (ziemno-wodne ssaki drapieżne), a wymagających zupełnie innego podejścia (kontrola i eradykacja populacji obcej i inwazyjnej N. vison oraz pilne i staranne zabiegi konserwatorskie wobec M. lutreola). Co więcej, pobór materiału genetycznego dla opisanego testu może mieć charakter nieinwazyjny, poprzez wykorzystanie pułapek włosowych do pobierania próbek sierści z cebulkami włosowymi.

    Nieinwazyjną metodę identyfikacji norki europejskiej, również o charakterze różnicującym względem tchórza zwyczajnego i norki (wizona) amerykańskiej, opracował zespół Gómez-Moliner i in.. Zaproponowany protokół opiera się na gniazdowej reakcji polimerazy (ang. nested-PCR) fragmentu sekwencji mitochondrialnego regionu kontrolnego (pętla D) i trawieniu otrzymanych amplikonów (długości 240 pz) mieszaniną restryktaz – RsaI i MspI. W rezultacie elektroforezy agarozowej produktów trawienia zidentyfikować można dwa haplotypy charakterystyczne dla M. lutreola, dwa dla M. putorius i jeden dla N. vison. Wielką zaletą metody jest fakt, że zaprojektowana została ona z myślą o pozyskiwanym w niewielkich ilościach, zdegradowanym DNA z próbek kału.

    Badania w obszarze genetyki populacyjnej M. lutreola dotyczą określenia zróżnicowania genetycznego pomiędzy zachowanymi populacjami gatunku. Analizy wewnątrzgatunkowej struktury genetycznej norki europejskiej wykazały stosunkowo wysokie, zwłaszcza w porównaniu z innymi przedstawicielami taksonu Mustelidae, zróżnicowanie genetyczne gatunku. Jednak zróżnicowanie to nie ma charakteru jednorodnego i różne populacje wykazują znacząco różny poziom zróżnicowania genetycznego. Badania Cabria i in., oparte na 11 loci mikrosatelitarnych, wykazały istnienie trzech odróżnialnych genetycznie populacji – północno-wschodniej (zamieszkującej tereny dorzecza Wołgi i Dwiny), zachodniej (zasiedlającej pd.-zach. Francję oraz pn. i zach. Hiszpanię) oraz południowo-wschodniej (występującej w Delcie Dunaju w Rumunii). Ustalone wartości parametrów oceniających zróżnicowanie genetyczne zestawiono w Tab. 1. Wskazują one na istnienie największej różnorodności genetycznej w populacji północno-wschodniej, nieco niższej w populacji rumuńskiej oraz znacząco niższej w populacji zachodniej. 

Podobne wyniki uzyskał Michaux i in., opierając międzypopulacyjną analizę zróżnicowania genetycznego norki europejskiej na kompletnej sekwencji pętli D genomu mitochondrialnego. Uzyskane przez nadmieniony zespół wyniki wykazały istnienie 15 haplotypów dla badanego fragmentu DNA w populacji rosyjsko-białoruskiej (18 przebadanych osobników), 4 haplotypy w populacji rumuńskiej (34 przebadane osobniki) i tylko jeden haplotyp dla populacji francusko-hiszpańskiej (124 przebadane osobniki). Zróżnicowanie nukleotydowe (π) i haplotypowe (h) wynosiło odpowiednio: dla populacji rosyjsko-białoruskiej – 0,0120 ± 0,0014 i 0,939 ± 0,058, dla populacji rumuńskiej – 0,0012 ± 0,0003 i 0,469 ± 0,088, dla populacji francusko-hiszpańskiej – 0 dla obu wskaźników. 

Tab. 1. Wskaźniki zróżnicowania genetycznego północno-wschodniej (NE), południowo-wschodniej (SE) i zachodniej (W) populacji norki europejskiej, w oparciu o 11 loci mikrosatelitarnych (źródło: Cabria i in. 2015)

N – liczba przebadanych osobników, N_A – liczba alleli, P_A – liczba alleli prywatnych, % P_A – procentowy udział alleli prywatnych w ogólnej liczbie alleli), A – różnorodność alleliczna, H_A – heterozygotyczność obserwowana, H_E – heterozygotyczność oczekiwana, F_IS – współczynnik wsobności

Do podobnych wniosków na temat zróżnicowania genetycznego trzech wymienionych populacji norki europejskiej doszli również Lodé, Davidson i in. oraz Cabria. Przyczyn dużej homogenności genetycznej populacji zamieszkujących obszar Francji i Hiszpanii upatruje się w efekcie wąskiego gardła i efekcie założyciela, które nastąpiły (lub następowały) w stosunkowo nieodległej przeszłości, a także ograniczonego przepływu genów.

    Chociaż liczba badań nad genetyką norki europejskiej jest stosunkowo niewielka, to należy podkreślić, że niemal wszystkie podejmowane obecnie w tym zakresie badania mają niezwykle istotny aspekt aplikacyjny. W bezpośredni sposób przyczyniają się one do zdobycia bardzo cennej, praktycznej wiedzy na temat planowania efektywnych zabiegów ochronnych ex situ (hodowla zachowawcza i odtworzeniowa) i in situ (programy reintrodukcji, zasilanie zanikających populacji dzikich osobnikami z zewnątrz), zarówno o charakterze doraźnym, jak i strategicznym. Jako takie, stanowią one doskonały przykład możliwości praktycznego wykorzystania genetyki konserwatorskiej. Wymienić należy w tym miejscu szczególnie cenne dla ratowania gatunku badania Lodé, Davison i in., Peltier i Lodé, Michaux i in., Michaux i in. oraz  Cabria i in.. Warto w tym miejscu również podkreślić, że jedynie genetyka konserwatorska dostarczyć może narzędzi do ratowania gatunku, którego dotknęło zjawisko tzw. spirali wymierania (ang. extinction vortex), co z kolei obliguje do podejmowania większej liczby inicjatyw badawczych w zakresie genetyki konserwatorskiej norki europejskiej.